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新生儿溶血病母体IgG抗体效价检测卡标准操作程序
来源:大發官方生物    发布时间:2009年11月21日

一、准备工作

(一)微柱凝胶试剂卡的准备:观察外观,如有干胶、杂质、气泡不可使用,之后将卡放置室温(1825℃)平

      衡,再用专用离心机离心5分钟。

(二)试剂配制:吸取2-Me14.7μl,加pH7.4磷酸盐缓冲液至1ml为0.2M 2-Me应用液;或用100ml pH7.4的PBS溶

      解0.154g二硫苏糖醇,即0.01M DTT;密闭,避光,保存于4℃冰箱内,可使用1个月。

(三)标本采集:抽取孕妇静脉血5ml,一般为不抗凝血,无需空腹。同时,提供3-4ml胎儿父亲的抗凝血,对判

      断母子血型的配合与否是十分有益的。

(四)红细胞标本的制备:用红细胞稀释液配制红细胞悬液,红细胞最终浓度为0.8%。

(五)血清标本的制备:将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心,取上清;或者将

      被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4放置12小时,或37放置2小时后离心,2000rpm,10分钟,取上

      清。该上清不得有絮状物或沉淀。取同体积的血清和2-Me(DTT)混匀,37℃孵育30~60分钟。

二、操作步骤

    1. 在试管中加入200ul母体血清和200ul 2-Me应用液(或DTT应用液),置37℃水浴3060分钟,以充分破坏

       血清中的IgM类抗体。

    2. 取6只干净试管,做好标记;第1管中加入处理后的血清50ul和350ul生理盐水,混匀(为1:16稀释);第

       2-6管中依次加200ul的生理盐水和前一管中的血 清200ul,做倍比稀释。

    3. 将卡标记好,依次将倍比稀释后的相应50ul血清分别加入标记孔中。

    4. 在所有孔中加入50ul父亲的0.8%红细胞悬液(或与父亲同型的A型或B型0.8%红细胞悬液),测定孕妇ABO

       血型系统IgG血型抗体;在所有孔中加入50ul标准O型 0.8%红细胞悬液,测定孕妇ABO血型系统以外IgG血

       型抗体。

    5. 加样后的试剂卡,置37℃孵育器中孵育15分钟

    6. 用专用离心机离心5分钟(900rpm 2分钟,1500rpm 3分钟), 取出,判定结果。 

三、结果判定:产生1+凝集的最高稀释度,其倒数即为效价

    1. 阳性结果:红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。

    2. 阴性结果:红细胞完全沉降到胶底部,在凝胶管底部形成红细胞扣。

    注:据文献报道卡式抗人球蛋白法测出的母体效价值比聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度。

四、注意事项

    1. 红细胞标本一定不能被细菌污染,否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如

       得不用过夜血或陈旧血,则必须首先用该标本做阴性对照试验,以确定该标本是否可以做本实验。

    2. 血清标本:血清标本必须充分去除纤维蛋白,否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出,阻碍红细胞沉

       淀,呈假阳性反应。

    3. 如在微柱凝胶中出现溶血现象,强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应,也不排除其他原因所致溶血,

       故对此标本一定认真分析,并向上级主管技术人员报告并讨论。

   4. 父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。

   5. 每日试验前,先取出微柱凝胶卡放置至室温。

    6. 试剂卡应放在18-25℃储存,如若长期放在4℃冰箱,建议每1-2个月取出,用专用离心机离心一次,

       以防止干胶或产生气泡。

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