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新生儿溶血病检测卡标准操作程序
来源:大發官方生物    发布时间:2009年11月21日

一、准备工作

(一)微柱凝胶试剂卡的准备:观察外观,如有干胶、杂质、气泡不可使用,之后将卡放置

室温(18-25℃)平衡,再用专用离心机离心5分钟。

(二)试剂的制备:6%牛血清白蛋白(盐水稀释)

(三)标本采集:采集被检对象静脉血,将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。

(四)红细胞标本的制备:用红细胞稀释液配制红细胞悬液,红细胞最终浓度为0.8%。

(五)血清标本的制备:将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离

心,取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃放置

2小时后离心,2000rpm,10分钟,取上清。该上清不得有絮状物或沉淀。

(六)热放散:充分洗涤红细胞至少三次,取同体积洗涤后的压积血和6%牛血清白蛋白混匀,

置于56℃孵育10分钟,期间不断摇动,离心3000rpm,2-3分钟,取上清。即放散液。

(七)酸放散:

1、取直接抗人球蛋白试验(DAT)阳性待检血样(或在体外已吸收血清的红细胞),离心尽

可能去除血或血浆。

2、用生理盐水洗涤待检红细胞4次,以除去未结合的抗体,留取约1ml的最后一次洗涤液。

3、配制酸放散液:取4体积的放散液A与1体积的放散液B混合均匀。

4、将1ml待检压积红细胞与1ml酸放散液混合均匀,室温孵育1-2分钟。

5、以3000rpm离心1分钟。

6、立即将酸放散液移到另一支干净试管中,并加入紫红色中和液调颜色至肉色或水粉色

(500ul放散液加入中和液60-80ul),此时PH值近中性。以3000rpm离心1-2分钟,

取上清即放散液。

7、放散液与最后一次洗涤液做平行检测。

8、用试管法或微柱凝胶抗人球蛋白卡检测,出现阴性反应,则需要加入人IgG致敏的红细胞

做确认试验,以保证抗人球蛋白试剂的有效性。

二、实验步骤

1、取新生儿的红细胞0.8%悬液50ul分别加入新生儿ABO、RhD血型检测卡(微柱凝胶)卡的

1-6孔中。

2、使用专用离心机离心5分钟(900rpm 2分钟,1500 rpm 3分钟)。

3、取出,判读结果。

4、新生儿卡Ⅱ1-3孔分别加入50ul新生儿血清,4-6孔分别加入50ul新生儿红细胞放散液。

5、将A型红细胞悬液50ul分别加入第1、4孔;将B型红细胞悬液50ul分别加入第2、5孔;

将O型红细胞悬液50ul分别加入第3、6孔中。

6、37℃孵育15分钟。

7、取出,使用专用离心机离心5分钟(900rpm2分钟,1500 rpm3分钟),取出,判读结果。

三、结果判定

阳性结果:红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。表明被检者血清中含有对应其抗原的抗体

或血细胞被致敏。

阴性结果:红细胞完全沉降到凝胶底部,在凝胶管底部形成红细胞扣。表明血清中无相应抗

原免疫的抗体或血细胞没有被致敏。

反应强度:特异性红细胞抗原抗体复合物位于胶表面,为强阳性反应;复合物在胶中为弱阳

性反应;愈靠近胶底部颗粒愈小,反应愈弱(2+或1+)。

直抗试验以出现凝集为阳性,游离和放散试验均以检出可以和新生儿红细胞反应的抗体

为阳性。

四、注意事项

1、红细胞标本一定不能被细菌污染,否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做

本实验。如不得不用过夜血或陈旧血,则必须首先用该标本做阴性对照试验,以确定该标

本是否可以做本实验。

2、血清标本:血清标本必须充分去除纤维蛋白,否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出,阻

碍红细胞沉淀,呈假阳性反应。

3、如在微柱凝胶中出现溶血现象,强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应,也不排除其他原因

所致溶血,故对此标本一定认真分析,并向上级主管技术人员多报告并讨论。

4、父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。

5、洗出尽量多红细胞进行放散;注意放散的温度不可超过56℃,以防溶血;天冷时放散液注

意保温;吸出尽可能多的放散液;注意除去放散液中残留的红细胞;放散前红细胞要充分

洗涤,至少三次。

6、每日试验前,先取出微柱凝胶卡放置至室温。

7、试剂卡应放在18-25℃储存,如若长期放在4℃冰箱,建议每1-2个月取出,用专用离心机

离心一次,以防止干胶或产生气泡。

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